显微镜有7种成像（明场BF、暗场DF、相差PH、微分干涉DIC、偏光POL、浮雕相衬RCHMC、荧光FL），除荧光之外都要调科勒照明。
科勒照明
视场光栅是下面的那个（这个要动），聚光镜上那个是孔径光栅（这个不动）
保证明场，注意ph应在4or5空位。
10x（黄色），调焦，视场光栅调小，移动聚光镜高度旋钮使得边缘最清晰：此时达到共轭面。
再到光斑内接以确认在中间，不在中间的话，用螺丝这样调整。再把光栅调到最大，注意激光器位置：光均匀。
各种成像模式的设置方法
DIC
4部件：棱镜x2（分光） 两片偏光镜（起偏 减偏）顺序：起棱棱解。
先调光路再找焦：
- 取下样品
- 10x
- 下面棱镜抽出来
- 点屏幕搞定3块镜（顺序：起偏、上棱镜、减偏（这块在荧光光路epi里）
- 正交位：取走目镜，能看到黑线（看到后把下面棱镜推进去），看不到调上面棱镜
- 在看样品的时候（调焦完之后）调下面棱镜，改变光程差
相差
- 10倍调焦，ph对应2，去掉样品和一个目镜，看到很亮一个环（其实是聚光器
- 换上对中望远镜
- 拧到最开，目视镜内缓缓拧进直至清晰，如果歪的话能看见2个环
拧聚光器环上的小螺丝，让亮的环对到灰的环上
荧光
激发光源和荧光的关系
短波长（能量大）–> 长波长（能量小）：
- 蓝👉绿
- 绿 👉红
正置vs倒置
- 活细胞适合 倒置显微镜
- 倒置的工作距离更长
步骤
控制器显示屏：
u：激发块；
f：盒子；
u/g/b：激发光色，ub bg gr ；
N narrow. W wide. A超级窄
- 找焦面和视野（明场，shutter要有光）z值变小，物镜远离标本，正倒置皆如此。 找块选颜色。
- 推拉杆切换镜下or相机
- 左上角实时观察
- 摄像控制：调曝光时间（左自动，右自动适配，然后左边微调）ctrl+h，用红色检查过曝光点，最好的状态是蓝色无所谓，一点点红点
- 读取设置，保存路径（右上角），选好要拍的通道（采集打勾），右上角开始，就拍了
- 保存为vsi（原始文件），再另存为tif保存。
tif含有颜色/标尺信息，然而一般打不开；所以在存tif之前要在vsi上显示信息，看上去是2个
共聚焦
- 开机顺序：全部硬件打开，然后小电脑，然后大电脑。按数字开也行：显微镜控制器 电动载物台 小电脑 大电脑 psu 汞灯 激光
- 常用：左上角菜单里5大类 3条光路
- 明场大致调焦（汞灯 ）换激发光，live再调焦面
模块：
左上角：只选最左边的即可
左中：曝光时间等，视野尺寸、光学放大等
中栏：
- average可增大信噪比
- 扫描模式
- 激光强度
1 目镜明场焦面
2 设定左上epi，LSM，中栏选染料，点live，相当于实时曝光，然后对着相机再定焦面
3 工具栏HiLo图片调稍亮（HV600），稍稍过曝，以减少激光强度，调其他参数，大小等，加标尺-
第一个百分比：激光强度
-
hv见上文
-
不用改gain
-
offset：一起变暗
-
**调不好可能是漂白 **
右上角start照相，右键输出
图像质量提升：
亮度对比度，以及
- 增加点光时间（但不超过8ms）
- 增加扫描分辨率（像素up）
- average降背景噪
- offset，（类似合并像素，慎用
右栏：
可以拍录像：每隔xx时间拍一张
可以拍3d：设定上下底面
右上存储路径、右键导出 。图栏工具栏可手动加标尺 。
图像分析处理ImageJ
- Merge
- 颜色通道filter 0.3%, 8bit，最后融合
- 加标尺（没信息的先set scale
定量
- binary（弄完还是8bit ）
- Analyse particles
